El proyecto del Dr. Benoit Gauthier

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Y DESARROLLO DEL PROYECTO

OBJETIVOS
Para verificar nuestra hipótesis y desarrollar este proyecto, proponemos tres objetivos específicos:

1. Examinar el impacto de BL001 sobre la transdiferenciación alfa-a-beta en ratón y determinar si Tregs y macrófagos M2 potencian este proceso.

Discerniremos si la modificación del balance de las poblaciones inmunes por BL001 propicia la transdiferenciación de célula alfa a célula beta, o es el efecto directo de BL001 sobre las células alfa. Provocaremos la destrucción de las células beta, y lo combinaremos con un marcaje y seguimiento (trazado del linaje) de las células alfa pancreáticas, que nos permitirá seguir la procedencia y el destino de las células alfa y ver si se transforman en células beta después de la destrucción de éstas últimas. 1) Para evaluar la acción directa de BL001 a la transdiferenciación en ausencia de un ataque autoinmune, una única inyección de una dosis alta de estreptozotocina (STZ, toxina que destruye selectivamente a las células beta), será administrada a ratones Glu-rtTA::TetO-Cre::ROSA26-lox-stop-lox-YFP, cuyas células alfa están marcadas con una proteína fluorescente. 2) Para evaluar la contribución de Tregs y macrófagos M2 a la transdiferenciación de células alfa a célula beta, combinaremos el modelo RIP-B7.1 de diabetes autoinmune experimental (DAE) inducida con el de marcaje y seguimiento de células alfa Glu-rtTA::TetO-Cre::ROSA26-lox-stop-lox-YFP. Así generaremos el modelo RIP-B7.1::Glu-rtTA::TetO- Cre::ROSA26-lox-stop-lox-YFP, que tendrá las células alfa marcadas con una proteína fluorescente y en el que induciremos diabetes autoinmune. En ambos modelos de seguimiento de células alfa y destrucción de células beta (STZ y DAE), los ratones serán pre-tratados con BL001 5 días antes de la inducción del daño. Posteriormente se determinarán los niveles de glucosa en sangre durante 8 semanas para establecer la incidencia de diabetes. Durante esas 8 semanas, se realizarán análisis del tejido pancreático en varios puntos temporales mediante inmunohistoquímica para detectar el porcentaje de células beta originadas por antiguas células alfa, así como moléculas/marcadores que se expresan durante la conversión de célula alfa a células beta. También se evaluará la infiltración de Tregs y macrófagos M2 mediante inmunofluorescencia y citometría de flujo. Posteriormente, para explorar si el reclutamiento por medio de BL001 de Tregs y macrófagos M2 está actuando sobre la conversión de célula alfa a beta, se suprimirán estas poblaciones celulares en el modelo combinado de seguimiento de célula alfa y diabetes autoinmune experimental, y se analizarán los parámetros descritos anteriormente.

2. Evaluar la contribución de las células ductales a la reposición del conjunto de células alfa bajo el tratamiento con BL001.

Las células ductales, localizadas en los conductos de la porción exocrina del páncreas, pueden originar células alfa nuevas (neogénesis). Determinaremos si BL001 estimula la neogénesis de nuevas células alfa, que posteriormente podrían transdiferenciarse a células beta.
En este caso combinaremos el modelo de diabetes autoinmune experimental (RIP-B7.1) con modelos de marcaje de células ductales para posterior trazado del linaje (HNF1b-creER::ROSA26-lox-stop-lox-B- Gal o Sox9-creER::ROSA26-lox-stop-lox-B-Gal). Así obtendremos ratones con las células ductales marcadas con una proteína fluorescente, para facilitar el seguimiento de las mismas, y en los que podremos inducir diabetes autoinmune experimental (DAE), denominados RIP-B7.1::HNF1b- creER::ROSA26-lox-stop-lox-B-Gal o RIP-B7.1::Sox9-creER::ROSA26-lox-stop-lox-B-Gal. Induciremos DAE en animales pre-tratados o no con BL001 5 días antes y mediante análisis de inmunohistoquímica determinaremos si hay células beta que proceden de las células ductales.

3. Explorar la capacidad de BL001 para promover la conversión de células alfa humanas a células beta humanas y si los macrófagos M2 humanos facilitan este proceso.

Examinaremos la acción de BL001 “in vitro” en tejidos/células humanas. Por un lado, si induce cambios directamente en células del sistema inmune, y por otro si los cambios potenciales inducidos por BL001 en macrófagos afectan a la conversión de células alfa a beta en el islote pancreático humano.
Puesto que es imposible adquirir Tregs humanos específicos de antígeno, utilizaremos inicialmente células mononucleares humanas de la sangre (PBMCs), tanto de donantes sanos como de pacientes con DMT1. Inicialmente se inducirá la maduración de los macrófagos de esas células sanguíneas, y posteriormente serán tratadas con BL001. Tras los tratamientos se caracterizarán las poblaciones de macrófagos en PBMCs para determinar subtipos M1 y M2, mediante técnicas de ELISA, citometría de flujo y qPCR. En paralelo, islotes humanos serán modificados para el marcaje de las células alfa, que nos permitirá el seguimiento posterior de las citadas células. Para ello los islotes serán transducidos con dos constructos lentivirales, que porten por un lado el promotor de ARX para la expresión de Cre (pARX-Cre), y por otro pCMV-LoxP-Stop-LoxP-GFP. El Dr. Collombat, colaborador en este proyecto, demostró recientemente que el promotor de ARX es más eficiente que el de glucagón para marcar específicamente a las células alfa, y así tendremos un mayor número de ellas marcadas con la proteína fluorescente. Nuestro protocolo optimizado y publicado recientemente será utilizado para la modificación (transducción) de los islotes humanos. A continuación, estos islotes humanos con las células alfa marcadas serán tratados con BL001. También islotes humanos modificados cultivados simultáneamente con macrófagos humanos (co-cultivos), serán tratados con BL001. Al final de los tratamientos, secciones de los islotes humanos serán procesadas para inmunohistoquímica donde se determinarán porcentaje de células alfa convertidas en células beta y otros marcadores de este proceso.

PLAN DE CUMPLIMIENTO DE LOS OBJETIVOS DE INVESTIGACIÓN